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1概述 

無(wú)菌藥品是指法定藥品標(biāo)準(zhǔn)中列有無(wú)菌檢查項(xiàng)目的制劑和原料藥，一般包括注射劑、無(wú)菌原料藥及滴眼劑等。從嚴(yán)格意義上講，無(wú)菌藥品應(yīng)完全不含有任何活的微生物，但由于目前檢驗(yàn)手段的局限性，絕對(duì)無(wú)菌的概念不能適用于對(duì)整批產(chǎn)品的無(wú)菌性評(píng)價(jià)，因此目前所使用的“無(wú)菌”概念，是概率意義上的“無(wú)菌”。一批藥品的無(wú)菌特性只能通過(guò)該批藥品中活微生物存在的概率低至某個(gè)可接受的水平，即無(wú)菌保證水平（Sterility Assurance Level, SAL）來(lái)表征。而這種概率意義上的無(wú)菌保證取決于合理且經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的滅菌工藝過(guò)程、良好的無(wú)菌保證體系以及生產(chǎn)過(guò)程中嚴(yán)格的GMP管理。 

無(wú)菌藥品通常的滅菌方式可分為：1）濕熱滅菌；2）干熱滅菌；3）輻射滅菌；4）氣體滅菌；5）除菌過(guò)濾。按工藝的不同分為最終滅菌工藝（sterilizing process）和無(wú)菌生產(chǎn)工藝（aseptic processing）。其中最終滅菌工藝系指將完成最終密封的產(chǎn)品進(jìn)行適當(dāng)滅菌的工藝，由此生產(chǎn)的無(wú)菌制劑稱為最終滅菌無(wú)菌藥品，濕熱滅菌和輻射滅菌均屬于此范疇。無(wú)菌生產(chǎn)工藝系指在無(wú)菌環(huán)境條件下，通過(guò)無(wú)菌操作來(lái)生產(chǎn)無(wú)菌藥品的方法，除菌過(guò)濾和無(wú)菌生產(chǎn)均屬于無(wú)菌生產(chǎn)工藝。部分或全部工序采用無(wú)菌生產(chǎn)工藝的藥品稱為非最終滅菌無(wú)菌藥品?；跓o(wú)菌藥品滅菌/除菌生產(chǎn)工藝的現(xiàn)狀，本指導(dǎo)原則主要對(duì)在注射劑與無(wú)菌原料藥的生產(chǎn)中比較常用的濕熱滅菌與無(wú)菌生產(chǎn)工藝進(jìn)行討論。本指導(dǎo)原則中的濕熱滅菌工藝驗(yàn)證主要包括滅菌條件的篩選和研究，濕熱滅菌的物理確認(rèn)，生物指示劑確認(rèn)等內(nèi)容；無(wú)菌生產(chǎn)工藝驗(yàn)證主要包括無(wú)菌分裝、除菌過(guò)濾、培養(yǎng)基模擬灌裝、過(guò)濾系統(tǒng)的驗(yàn)證等驗(yàn)證內(nèi)容。 

最終滅菌工藝和無(wú)菌生產(chǎn)工藝實(shí)現(xiàn)產(chǎn)品無(wú)菌的方法有本質(zhì)上的差異，從而決定了由這兩類工藝生產(chǎn)的產(chǎn)品應(yīng)該達(dá)到的最低無(wú)菌保證水平的巨大差異。最終滅菌無(wú)菌產(chǎn)品的無(wú)菌保證水平為殘存微生物污染概率≤10-6，非最終滅菌無(wú)菌產(chǎn)品的無(wú)菌保證水平至少應(yīng)達(dá)到95%置信限下的污染概率<0.1%。由此可見(jiàn)，非最終滅菌無(wú)菌產(chǎn)品存在微生物污染的概率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于最終滅菌無(wú)菌產(chǎn)品，為盡量減少非最終滅菌無(wú)菌產(chǎn)品污染微生物的概率，鼓勵(lì)企業(yè)在生產(chǎn)中采用隔離艙等先進(jìn)技術(shù)設(shè)備。 

基于質(zhì)量源于設(shè)計(jì)的藥品研發(fā)與質(zhì)量控制的理念，為保證無(wú)菌藥品的無(wú)菌保證水平符合要求，研發(fā)者在產(chǎn)品的研發(fā)過(guò)程中應(yīng)根據(jù)藥品的特性選擇合適的滅菌方式，并系統(tǒng)地評(píng)估生產(chǎn)的各環(huán)節(jié)及各種因素對(duì)無(wú)菌保證水平的影響，根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)的高低與風(fēng)險(xiǎn)發(fā)生的可能性等來(lái)針對(duì)性地驗(yàn)證滅菌工藝的可靠性，驗(yàn)證的內(nèi)容、范圍與批數(shù)等取決于工藝與產(chǎn)品的復(fù)雜性以及生產(chǎn)企業(yè)對(duì)類似工藝的經(jīng)驗(yàn)多少等因素。只有在研發(fā)中經(jīng)過(guò)系統(tǒng)而深入的研究與驗(yàn)證，獲得可靠的滅菌工藝，并在日常的生產(chǎn)過(guò)程中嚴(yán)格執(zhí)行該工藝，才能真正保證每批藥品的無(wú)菌保證水平符合預(yù)期的要求。當(dāng)然，在藥品的整個(gè)生命周期內(nèi)，隨著對(duì)所生產(chǎn)的藥品的特性和生產(chǎn)工藝等的了解越來(lái)越全面和深入，滅菌工藝也在不斷的完善，此時(shí)就會(huì)涉及到對(duì)變更后的工藝如何進(jìn)行驗(yàn)證的問(wèn)題，本指導(dǎo)原則也適用于此種情況。 

由于滅菌/除菌工藝驗(yàn)證的工作在我國(guó)開(kāi)展的時(shí)間不長(zhǎng)，基礎(chǔ)還不牢靠，因此必然在實(shí)際工作中會(huì)遇到很多難以預(yù)料的問(wèn)題，故本指導(dǎo)原則只是一個(gè)一般性原則，藥物研發(fā)者應(yīng)從藥物研發(fā)的客觀規(guī)律出發(fā)，具體問(wèn)題具體分析，必要時(shí)根據(jù)實(shí)際情況采用其他有效的方法和手段。同時(shí)，本指導(dǎo)原則作為階段性產(chǎn)物，必將隨著藥物研究者與評(píng)價(jià)者對(duì)滅菌工藝研究與驗(yàn)證的認(rèn)知加深，而不斷進(jìn)行修訂與完善。 

2制劑濕熱滅菌工藝 

2.1濕熱滅菌工藝的研究 

2.1.1 濕熱滅菌工藝的確定依據(jù) 

滅菌工藝的選擇一般按照滅菌工藝的決策樹(shù)（詳見(jiàn)附件1）進(jìn)行，濕熱滅菌工藝是決策樹(shù)中首先考慮的滅菌工藝。濕熱滅菌法是利用高壓飽和蒸汽、過(guò)熱水噴淋等手段使微生物菌體中的蛋白質(zhì)、核酸發(fā)生變性而殺滅微生物的方法。高溫在殺滅微生物的同時(shí)，可能對(duì)藥品的質(zhì)量也有所影響。如果產(chǎn)品不能耐受濕熱滅菌，則需要考慮采用無(wú)菌生產(chǎn)工藝。所以，對(duì)于藥品的滅菌工藝的考察和確定，首先是考察其能否采用濕熱滅菌工藝，能否耐受濕熱滅菌的高溫。 

目前濕熱滅菌方法主要有兩種：過(guò)度殺滅法（F0≥12）和殘存概率法（8≤F0<12）。用其它F0值小于8的終端滅菌條件的工藝，則應(yīng)該按照無(wú)菌生產(chǎn)工藝要求。 

以上兩種濕熱滅菌方法都可以在實(shí)際生產(chǎn)中使用，具體選擇哪種滅菌方法，在很大程度上取決于被滅菌產(chǎn)品的熱穩(wěn)定性。藥物是否能耐受濕熱滅菌工藝的高溫，除了與藥物活性成分的化學(xué)性質(zhì)相關(guān)外，還與活性成分存在的環(huán)境密切相關(guān)，所以在初期的工藝設(shè)計(jì)過(guò)程中需要通過(guò)對(duì)藥物熱穩(wěn)定性進(jìn)行綜合分析，以確定能否采用濕熱滅菌工藝。 

2.1.1.1活性成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與穩(wěn)定性 

通過(guò)對(duì)活性成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，可以初步判斷活性成分的穩(wěn)定性，如果活性成分結(jié)構(gòu)中含有一些對(duì)熱不穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)基團(tuán)，則提示主成分的熱穩(wěn)定性可能較差。在此基礎(chǔ)之上，還應(yīng)該通過(guò)設(shè)計(jì)一系列的強(qiáng)制降解試驗(yàn)對(duì)活性成分的穩(wěn)定性做進(jìn)一步研究確認(rèn)，了解活性成分在各種條件下可能發(fā)生的降解反應(yīng)，以便在處方工藝的研究中采取針對(duì)性的措施，保障產(chǎn)品能夠采用濕熱滅菌工藝。 

2.1.1.2 處方工藝的研究 

在對(duì)活性成分的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與穩(wěn)定性進(jìn)行研究的基礎(chǔ)上，可以有針對(duì)性的進(jìn)行處方工藝的優(yōu)化研究。如活性成分易發(fā)生氧化反應(yīng)，則需要考慮是否需要在工藝中去除氧并采取充氮的生產(chǎn)工藝，或在處方中加入適宜的抗氧劑；如活性成分的穩(wěn)定性與pH值相關(guān)，則需要通過(guò)研究尋找最利于主成分穩(wěn)定性的pH值，當(dāng)然此時(shí)需要關(guān)注該pH值在臨床治療時(shí)能否接受；如果主成分是因?yàn)槟承╇s質(zhì)的存在影響了穩(wěn)定性，則需要通過(guò)適宜的手段去除相關(guān)的雜質(zhì)；如果是主成分在某種溶劑系統(tǒng)中穩(wěn)定性較差，則需要考慮更換溶劑系統(tǒng)，此時(shí)同樣需要考慮所選用的溶劑系統(tǒng)在臨床應(yīng)用時(shí)能否被接受；濕熱滅菌的不同滅菌溫度和滅菌時(shí)間的組合對(duì)產(chǎn)品的穩(wěn)定性的要求有所不同，可以在保證提供所需的SAL的基礎(chǔ)上，通過(guò)滅菌時(shí)間和滅菌溫度的調(diào)整來(lái)確定藥物可以耐受的濕熱滅菌工藝。 

總之，需要通過(guò)各個(gè)方面的研究，使藥物盡可能的可以采用濕熱滅菌工藝。只有在理論和實(shí)踐均證明即使采用了各種可行的技術(shù)方法之后，活性成分依然無(wú)法耐受濕熱滅菌的工藝時(shí)，才能選擇無(wú)菌保證水平較低的無(wú)菌生產(chǎn)工藝。 

2. 2.1.3穩(wěn)定性研究 

無(wú)論使用何種設(shè)計(jì)方法，都需要進(jìn)行最終滅菌產(chǎn)品的穩(wěn)定性研究?？疾熳罱K滅菌程序?qū)Ξa(chǎn)品性質(zhì)穩(wěn)定性影響的試驗(yàn)可包括產(chǎn)品的降解、含量、pH值、顏色、緩沖能力以及產(chǎn)品的其它質(zhì)量特性。 

滅菌時(shí)，殺滅微生物的效果和活性成分的降解都隨著時(shí)間和溫度而累積。這意味著加熱和冷卻的變化將影響產(chǎn)品的穩(wěn)定性，同時(shí)影響殺滅效果。因此，穩(wěn)定性研究用樣品最好選取處于最苛刻的滅菌條件的產(chǎn)品，如：可采用在熱穿透試驗(yàn)中F0最大的位置上滅菌的產(chǎn)品進(jìn)行穩(wěn)定性考察，以確保滅菌產(chǎn)品的質(zhì)量仍能符合要求。 

2.1.2過(guò)度殺滅法的工藝研究 

通常來(lái)說(shuō)，與殘存概率法相比，過(guò)度滅殺法所需的被滅菌品開(kāi)始生產(chǎn)階段和日常監(jiān)控階段生物負(fù)荷的信息較少，但是過(guò)度殺滅要求的熱能比較大，其后果是被滅菌品降解的可能性增大。 

過(guò)度殺滅法的目標(biāo)是確保達(dá)到一定程度的無(wú)菌保證水平，而不管被滅菌產(chǎn)品初始菌的數(shù)量及其耐熱性如何。過(guò)度殺滅法假設(shè)的生物負(fù)荷和耐熱性都高于實(shí)際數(shù)，而大多數(shù)微生物的耐熱性都比較低，很少發(fā)現(xiàn)自然生成的微生物的D121℃值大于0.5分鐘。因此，過(guò)度殺滅的滅菌程序理論上能完全殺滅微生物，從而能提供很高的無(wú)菌保證值。由于該方法已經(jīng)對(duì)生物負(fù)荷及耐熱性作了最壞的假設(shè)，從技術(shù)角度看，對(duì)被滅菌品進(jìn)行初始菌監(jiān)控就沒(méi)有多大必要了。 
但這并不意味著生產(chǎn)過(guò)程中對(duì)污染可以完全不加控制。僅從控制熱原的角度，也應(yīng)當(dāng)遵循工藝衛(wèi)生規(guī)范，控制產(chǎn)品的微生物污染。如果實(shí)際生產(chǎn)中能夠嚴(yán)格遵循GMP的要求，這一點(diǎn)是可以實(shí)現(xiàn)的。 

2.1.3殘存概率法的工藝研究 

與過(guò)度殺滅法相比，殘存概率法方法所需的信息量要大得多，包括被滅菌品生產(chǎn)開(kāi)始階段及常規(guī)生產(chǎn)階段的信息、指示菌（對(duì)滅菌程序呈現(xiàn)強(qiáng)耐熱性的試驗(yàn)菌）以及生物負(fù)荷的信息。只有積累了這類有價(jià)值的信息后，才能制定比過(guò)度殺滅法F0值低的熱力滅菌程序，同時(shí)產(chǎn)品的無(wú)菌保證水平不會(huì)降低。使用熱力較低滅菌程序更有利于藥品的穩(wěn)定性，使產(chǎn)品的有效期延長(zhǎng)。正是因?yàn)檫@個(gè)原因，殘存概率法更適合那些處方耐熱性較差的最終滅菌產(chǎn)品。

 
通常說(shuō)來(lái)，不耐熱藥品的滅菌可能不能使用過(guò)度殺滅法，需要設(shè)計(jì)一個(gè)滅菌程序能夠恰當(dāng)?shù)貧缟镓?fù)荷，同時(shí)不導(dǎo)致產(chǎn)品不可接受的降解。這種情況下，滅菌程序的確認(rèn)就需研究產(chǎn)品的生物負(fù)荷和耐熱性。根據(jù)以下公式可以比較清楚的說(shuō)明這一點(diǎn)： 

無(wú)菌保證值= F0 / D - lgN0 

其中，無(wú)菌保證值是SAL的負(fù)對(duì)數(shù)，N0為滅菌開(kāi)始時(shí)產(chǎn)品中的污染微生物總數(shù)，D為污染微生物的耐熱參數(shù)。所以，菌工藝的無(wú)菌保證值與F0、N0、D密切相關(guān)。 

2.1.3.1 滅菌前生物負(fù)荷的控制 

采用殘存概率法進(jìn)行終端滅菌的產(chǎn)品，除了需要關(guān)注滅菌過(guò)程本身，還需要在生產(chǎn)過(guò)程中采用一些適當(dāng)?shù)氖侄蝸?lái)監(jiān)測(cè)和控制藥品滅菌前的生物負(fù)荷。具體的措施通常包括滅菌前微生物數(shù)量與耐熱性的監(jiān)測(cè)、藥液過(guò)濾、工藝參數(shù)的控制等等。 

滅菌前微生物污染水平的監(jiān)測(cè)將在下面的章節(jié)詳細(xì)闡述。產(chǎn)品過(guò)濾在終端滅菌的產(chǎn)品中僅僅作為輔助的控制手段，但是在工藝確定的過(guò)程中，也應(yīng)該對(duì)濾膜的孔徑、材質(zhì)、濾器的使用周期進(jìn)行必要的篩選。在工藝參數(shù)控制方面，由于微生物的特性，通常在藥液放置期間也會(huì)逐漸繁殖，尤其一些營(yíng)養(yǎng)型的注射液，如葡萄糖注射液、復(fù)方氨基酸注射液等，其環(huán)境更有利于微生物的生長(zhǎng)和繁殖，因此應(yīng)通過(guò)工藝篩選和驗(yàn)證來(lái)確定溶液配制至過(guò)濾前、以及過(guò)濾后至滅菌前能夠放置的最長(zhǎng)時(shí)限，并相應(yīng)確定產(chǎn)品的批量、生產(chǎn)周期等關(guān)鍵工藝參數(shù)。 

2.1.3.2 滅菌前微生物污染的監(jiān)測(cè) 

滅菌前微生物污染水平的監(jiān)測(cè)應(yīng)在正常生產(chǎn)過(guò)程中取樣并覆蓋整個(gè)生產(chǎn)過(guò)程，取樣設(shè)計(jì)應(yīng)選取生產(chǎn)過(guò)程中污染最大，最有代表性的樣品，且要充分考慮到產(chǎn)品從灌封到滅菌前的放置時(shí)間。一般而言，如果灌裝持續(xù)一段時(shí)間，可從每批產(chǎn)品灌裝開(kāi)始、中間及結(jié)束時(shí)分別取樣。污染水平檢查可以采用如下的方法：先用滅菌的5%吐溫充分濕潤(rùn)0.45um的濾膜，然后定量過(guò)濾藥液，將此濾膜移至營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，在30~35℃下培養(yǎng)3~7天，計(jì)數(shù)。 

分離獲得的污染菌需要進(jìn)行耐熱性的檢查。污染菌的耐熱性檢查可以采用以下的測(cè)定方法：先用滅菌的5%吐溫充分潤(rùn)濕0.45um 的濾膜，然后過(guò)濾污染水平監(jiān)測(cè)所取的藥液樣品，再將此膜移至裝有無(wú)菌的待監(jiān)測(cè)產(chǎn)品的試管中，在沸水浴上煮沸約30分鐘，然后在30-35℃下在硫乙醇酸鹽肉湯中培養(yǎng)，觀察是否有耐熱菌生長(zhǎng)。 

當(dāng)耐熱性檢查發(fā)現(xiàn)藥液存在耐熱污染菌污染時(shí)，可采用定時(shí)煮沸法將它和已知的生物指示劑的耐熱性加以比較，必要時(shí)，可再測(cè)試耐熱污染菌的D值（D值的具體檢測(cè)方法詳見(jiàn)附件2），然后根據(jù)滅菌的F0值及污染菌的數(shù)量與耐熱性對(duì)產(chǎn)品的無(wú)菌做出評(píng)價(jià)。當(dāng)產(chǎn)品微生物污染水平超標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，應(yīng)對(duì)污染菌進(jìn)行鑒別、調(diào)查污染菌的來(lái)源并采用相應(yīng)的糾正措施。 

2.2濕熱滅菌工藝的驗(yàn)證 

濕熱滅菌工藝的驗(yàn)證一般分為物理驗(yàn)證和生物學(xué)驗(yàn)證兩部分，物理驗(yàn)證包括熱分布、熱穿透試驗(yàn)，生物學(xué)驗(yàn)證主要是微生物挑戰(zhàn)試驗(yàn)。物理驗(yàn)證是證實(shí)滅菌效果的間接方式，而微生物挑戰(zhàn)試驗(yàn)則直接反映滅菌的效果，兩者不能相互替代。 

2.2.1物理確認(rèn) 

2.2.1.1空載熱分布試驗(yàn) 

空載熱分布的目的是主要是了解整個(gè)滅菌設(shè)備的運(yùn)行情況，確認(rèn)滅菌室內(nèi)的溫度均勻性，測(cè)定滅菌腔內(nèi)不同位置的溫差狀況，確定可能存在的冷點(diǎn)?？蛰d熱分布試驗(yàn)通常采用足夠數(shù)量的熱電偶或熱電阻作溫度探頭，進(jìn)行編號(hào)后將它們固定在滅菌柜腔室的不同位置。溫度探頭的安放位置需要根據(jù)設(shè)備類型和不同位置下的滅菌風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估而定，應(yīng)包括可能的高溫點(diǎn)、低溫點(diǎn)，滅菌柜溫度控制探頭處、靠近溫度記錄探頭處，其他的探頭可以均勻地分布于滅菌柜腔室內(nèi)，以使溫度的檢測(cè)具有較好的代表性。溫度探頭在試驗(yàn)前后至少需要兩個(gè)溫度點(diǎn)進(jìn)行校正。溫度探頭安放結(jié)束后，即可以按照設(shè)定的滅菌程序進(jìn)行滅菌。 

2.2.1.2裝載熱分布試驗(yàn) 

裝載熱分布試驗(yàn)的目的是了解設(shè)備在裝載條件下內(nèi)部的溫度分布狀況，包括高溫點(diǎn)、低溫點(diǎn)的位置，為后續(xù)的評(píng)估和驗(yàn)證打下基礎(chǔ)。裝載熱分布一般在空載熱分布的基礎(chǔ)上進(jìn)行。溫度探頭的個(gè)數(shù)和安放的位置一般同空載熱分布試驗(yàn)，注意一定要在空載熱分布試驗(yàn)確定的冷點(diǎn)安放溫度探頭。溫度探頭安放在待滅菌的容器的周圍，注意不能介入待滅菌的容器。 

裝載熱分布試驗(yàn)需要考慮最大、最小和生產(chǎn)過(guò)程中典型裝載量情況，進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)盡可能使用待滅菌產(chǎn)品，如果采用類似物，應(yīng)結(jié)合產(chǎn)品的熱力學(xué)性質(zhì)等進(jìn)行適當(dāng)?shù)娘L(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。待滅菌產(chǎn)品的裝載方式和滅菌工藝的各項(xiàng)參數(shù)的設(shè)定應(yīng)與正常生產(chǎn)時(shí)一致，應(yīng)采用圖表的方式說(shuō)明產(chǎn)品的裝載情況，并評(píng)估探頭放置是否合理。如果待滅菌產(chǎn)品存在不同包裝規(guī)格或濃度規(guī)格，應(yīng)評(píng)估驗(yàn)證所采用的樣品和裝載方式是否能充分反映所有樣品的實(shí)際裝載情況。每一裝載量的熱分布試驗(yàn)需要至少進(jìn)行三次。溫度探頭在試驗(yàn)前后同樣均需要進(jìn)行校正。 

2.2.1.3 熱穿透試驗(yàn) 

熱穿透試驗(yàn)是考察滅菌柜和滅菌程序?qū)Υ郎缇a(chǎn)品適用性的一項(xiàng)試驗(yàn)。熱穿透試驗(yàn)的目的是確認(rèn)產(chǎn)品內(nèi)部也能達(dá)到預(yù)定的滅菌溫度。對(duì)于藥物而言，滅菌程序既要賦予產(chǎn)品一定的F0值，以保障產(chǎn)品的SAL≤10－6 。同時(shí)滅菌程序又不應(yīng)使產(chǎn)品受熱過(guò)度而造成藥物部分降解，以致同一滅菌批次的產(chǎn)品出現(xiàn)質(zhì)量不均一。 

熱穿透試驗(yàn)所用的溫度探頭的個(gè)數(shù)和安放位置需要根據(jù)熱分布試驗(yàn)的結(jié)果確定。一般可以采用足夠數(shù)量的溫度探頭。應(yīng)將熱穿透溫度探頭置于液體容器中的冷點(diǎn)，即整個(gè)包裝中最難滅菌的位置。如果有數(shù)據(jù)支持或有證據(jù)表明將探頭放在產(chǎn)品包裝之外也能夠反映出產(chǎn)品的熱穿透情況，風(fēng)險(xiǎn)能夠充分得到控制，也可以考慮將探頭放在容器之外。插有溫度探頭的產(chǎn)品的安放位置包括熱分布試驗(yàn)確定的冷點(diǎn)和高溫點(diǎn)、其他可能的高溫點(diǎn)、滅菌柜溫度探頭附近、溫度記錄探頭處。 

熱穿透試驗(yàn)的步驟及要求與裝載的熱分布試驗(yàn)基本相同，每一裝載方式的熱穿透試驗(yàn)也需要至少進(jìn)行三次。通過(guò)熱穿透試驗(yàn)可以確定在設(shè)定的滅菌程序下，滅菌柜內(nèi)各個(gè)位置的待滅菌產(chǎn)品是否能夠到達(dá)設(shè)定的溫度。結(jié)合滅菌前微生物污染的檢測(cè)，可以確定滅菌柜內(nèi)各個(gè)位置的待滅菌產(chǎn)品是否能夠獲得設(shè)定的F0值。 

對(duì)于F0值最大點(diǎn)位置的樣品，由于其受熱情況最為強(qiáng)烈，因此應(yīng)評(píng)估該位置下產(chǎn)品的穩(wěn)定性情況，以進(jìn)一步確認(rèn)滅菌對(duì)于產(chǎn)品的穩(wěn)定性沒(méi)有影響。 

2.2.1.4熱分布和熱穿透試驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析處理  

在物理確認(rèn)試驗(yàn)中，應(yīng)確認(rèn)關(guān)鍵和重要的操作參數(shù)并有相應(yīng)的文件和記錄。通常需要關(guān)注的主要參數(shù)包括 
-        每個(gè)探頭所測(cè)得溫度的變化范圍 
-        不同探頭之間測(cè)得的溫度變化范圍 
-        探頭測(cè)得的溫度與設(shè)定溫度之間的差值 
-        探頭測(cè)得超過(guò)設(shè)定溫度的最短及最長(zhǎng)時(shí)間 
-        F0 的下限及上限 
-        滅菌階段結(jié)束時(shí)的最低F0值 
-        滅菌階段的最低和最高壓力 
-        飽和蒸汽溫度和壓力之間的關(guān)系 
-        滅菌階段腔室的最低和最高溫度 
-        熱穿透溫度探頭之間的最大溫差或F0 的變化范圍 
-        熱分布試驗(yàn)中溫度探頭間的最大溫差 
-        最長(zhǎng)平衡時(shí)間 
-        最少正常運(yùn)行的探頭數(shù) 

合格標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)結(jié)合滅菌條件、滅菌設(shè)備的特點(diǎn)以及產(chǎn)品的實(shí)際情況制定。通常情況下，滅菌柜腔室最冷、最熱點(diǎn)和平均溫度之間的溫差應(yīng)不超過(guò)2.5℃。保溫時(shí)間內(nèi)溫度波動(dòng)應(yīng)在±1.0℃之內(nèi)，如果溫度差別過(guò)大，提示滅菌柜的性能不符合要求，需要尋找原因并進(jìn)行改進(jìn)，重新進(jìn)行驗(yàn)證。另外對(duì)于熱敏感的藥物，還應(yīng)該控制滅菌柜的升溫和降溫時(shí)間，以保證熱能的輸入控制在合理的范圍以內(nèi)，不會(huì)對(duì)產(chǎn)品的熱穩(wěn)定性造成影響。 

2.2.2 生物學(xué)確認(rèn) 

濕熱滅菌工藝的微生物挑戰(zhàn)試驗(yàn)是指將一定量已知D值的耐熱孢子（生物指示劑）在設(shè)定的濕熱滅菌條件下滅菌，以驗(yàn)證設(shè)定的滅菌工藝是否確實(shí)能達(dá)到產(chǎn)品所需的標(biāo)準(zhǔn)滅菌時(shí)間和F0。此項(xiàng)驗(yàn)證工作能夠如實(shí)反映滅菌工藝條件對(duì)微生物的殺滅效果，從而證明該滅菌工藝所賦予相關(guān)產(chǎn)品的無(wú)菌保證水平是否符合要求。 

2.2.2.1生物指示劑選用的一般原則 

一般情況下，生物指示劑選擇的原則性要求是：孢子穩(wěn)定、非致病菌、易于培養(yǎng)、有效期長(zhǎng)、保存及使用方便、安全性好。針對(duì)具體的滅菌工藝和具體的產(chǎn)品，還應(yīng)注意所用的生物指示劑的耐熱性應(yīng)強(qiáng)于待滅菌產(chǎn)品中的污染菌。 

濕熱滅菌工藝常用的生物指示劑有以下幾種，嗜熱脂肪芽孢桿菌，枯草芽孢桿菌，凝結(jié)芽孢桿菌，梭狀芽孢桿菌等。對(duì)于采用過(guò)度殺滅法的滅菌程序，生物指示劑系統(tǒng)主要是嗜熱脂肪芽孢桿菌的孢子。殘存概率法由于其熱輸入量比較低，因此在驗(yàn)證中使用的生物指示劑的耐熱性可以小于嗜熱脂肪芽孢桿菌的孢子。 

2.2.2.2生物指示劑的使用和放置 

實(shí)際驗(yàn)證過(guò)程中可以直接采用市售的生物指示劑成品或?qū)⑸镏甘緞┙臃N在待滅菌產(chǎn)品上。采用市售品時(shí)，只要供應(yīng)商具有相應(yīng)的質(zhì)量體系認(rèn)證資質(zhì)，在測(cè)試中其提供的生物指示劑的D值就可以被接受。采用將生物指示劑接種到待滅菌產(chǎn)品的方法，由于生物指示劑在不同介質(zhì)或環(huán)境中的耐熱性會(huì)有所不同，首先應(yīng)考慮產(chǎn)品對(duì)生物指示劑耐熱性的影響。所以對(duì)于具體的品種而言，如果需要將生物指示劑接種至產(chǎn)品之中，應(yīng)測(cè)定生物指示劑在該產(chǎn)品中的耐熱性，即D值。如果生物指示劑與產(chǎn)品不相容，可以用與產(chǎn)品相似的溶液來(lái)代替產(chǎn)品。 

生物指示劑的用量需要根據(jù)生物指示劑在待滅菌樣品中的耐熱性來(lái)確定，其用量應(yīng)符合挑戰(zhàn)性試驗(yàn)的要求。生物指示劑的用量可以采用陰性分?jǐn)?shù)法或者殘存曲線法計(jì)算，可以根據(jù)實(shí)際情況（如污染菌的耐熱性，擬用的生物指示劑的D值等）選擇合適的計(jì)算方法，具體檢測(cè)方法見(jiàn)附件3。 

應(yīng)結(jié)合產(chǎn)品特點(diǎn)和熱分布、熱穿透的實(shí)際結(jié)果來(lái)確定生物指示劑的放置位置。裝有生物指示劑的容器應(yīng)緊挨于裝有測(cè)溫探頭的容器，在滅菌設(shè)備的冷點(diǎn)處必需放置生物指示劑。滅菌柜的其他部位應(yīng)裝載產(chǎn)品或者類似物，以盡可能的模仿實(shí)際生產(chǎn)時(shí)的狀況。 

2.2.2.3滅菌 

生物指示劑的驗(yàn)證應(yīng)該按照產(chǎn)品設(shè)定的滅菌工藝進(jìn)行滅菌。 

2.2.2.4檢查和培養(yǎng) 

可以根據(jù)生物指示劑的生長(zhǎng)特性以及驗(yàn)證時(shí)的包裝方式，采用適當(dāng)?shù)姆椒ㄟM(jìn)行檢查和培養(yǎng)。將指示劑放入培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。需要注意不同的生物指示劑所需要的培養(yǎng)條件也各不相同，針對(duì)使用的生物指示劑確定培養(yǎng)條件，同時(shí)應(yīng)放置陰性和陽(yáng)性對(duì)照樣品。 

2.2.3.5試驗(yàn)結(jié)果的評(píng)價(jià) 

根據(jù)生物指示劑的D值和接種量推算產(chǎn)品在滅菌過(guò)程中實(shí)際達(dá)到的SAL值。驗(yàn)證新的滅菌工藝時(shí)，每個(gè)產(chǎn)品的每個(gè)規(guī)格的每一滅菌程序，至少需要連續(xù)進(jìn)行三次生物指示劑驗(yàn)證試驗(yàn)。如果試驗(yàn)的重現(xiàn)性好，所有試驗(yàn)的結(jié)果均提示SAL≤10-6，則驗(yàn)證結(jié)果提示該滅菌工藝為驗(yàn)證合格的滅菌工藝。如果各次驗(yàn)證的結(jié)果不一致，需要分析原因，采取相應(yīng)的改進(jìn)措施后重新進(jìn)行驗(yàn)證工作。 

3制劑無(wú)菌生產(chǎn)工藝 

3.1無(wú)菌生產(chǎn)工藝的研究 

無(wú)菌藥品應(yīng)首選采用終端滅菌工藝。如不能耐受終端滅菌工藝條件，應(yīng)盡量?jī)?yōu)化處方工藝，以改善其耐熱性。如確實(shí)無(wú)法耐受終端滅菌工藝，則可采用無(wú)菌生產(chǎn)工藝。無(wú)菌生產(chǎn)工藝通常包括無(wú)菌分裝生產(chǎn)工藝和除菌過(guò)濾生產(chǎn)工藝。 

3.1.1無(wú)菌分裝生產(chǎn)工藝的研究 

無(wú)菌分裝生產(chǎn)工藝是將采用經(jīng)驗(yàn)證的滅菌/除菌工藝過(guò)程處理后的原料藥或者原料藥和輔料，用無(wú)菌生產(chǎn)的方法分裝到采用經(jīng)驗(yàn)證的滅菌工藝處理的容器中，密封得到的。無(wú)菌分裝生產(chǎn)工藝的工藝研究和生產(chǎn)過(guò)程控制的重點(diǎn)是影響無(wú)菌保證水平的工藝步驟，主要包括物料（包括原料藥、輔料、內(nèi)包裝材料等）的質(zhì)量控制、原材料暴露于環(huán)境中可能再污染的操作步驟等。 

關(guān)于物料的質(zhì)量控制，采用無(wú)菌分裝生產(chǎn)工藝的制劑所涉及的各種物料，都必須采用適當(dāng)?shù)臏缇?除菌工藝處理后方可使用。各種物料的滅菌/除菌工藝，都應(yīng)是經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的、控制良好的工藝。同時(shí)需要對(duì)各種物料的無(wú)菌性、細(xì)菌內(nèi)毒素水平等進(jìn)行嚴(yán)格控制，通過(guò)研究確定相應(yīng)的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。 

無(wú)菌分裝的生產(chǎn)工藝是將原料藥或者原料藥和輔料經(jīng)分裝設(shè)備分裝至內(nèi)包裝材料中后密封得到。分裝步驟是影響產(chǎn)品質(zhì)量和無(wú)菌保證水平的關(guān)鍵生產(chǎn)步驟，應(yīng)結(jié)合生產(chǎn)設(shè)備和產(chǎn)品特點(diǎn)進(jìn)行工藝參數(shù)的研究，包括分裝速度和分裝時(shí)間等。 

無(wú)菌分裝生產(chǎn)工藝能否達(dá)到設(shè)定的無(wú)菌保證水平，與整個(gè)生產(chǎn)過(guò)程的控制密切相關(guān)，應(yīng)按照GMP要求及產(chǎn)品具體生產(chǎn)工藝情況進(jìn)行生產(chǎn)環(huán)境和生產(chǎn)過(guò)程的控制。在進(jìn)行無(wú)菌生產(chǎn)工藝驗(yàn)證時(shí)，應(yīng)采用最差條件進(jìn)行驗(yàn)證，在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中，對(duì)生產(chǎn)過(guò)程和工藝參數(shù)的控制均不能超過(guò)經(jīng)驗(yàn)證的最差條件的控制范圍。 

3.1.2 過(guò)濾除菌生產(chǎn)工藝的研究 

過(guò)濾除菌的無(wú)菌生產(chǎn)工藝是通過(guò)除菌過(guò)濾器，將藥液中的微生物除去得到無(wú)菌濾液。采用過(guò)濾除菌工藝時(shí)，同樣需要對(duì)影響無(wú)菌保證水平的工藝步驟及工藝參數(shù)進(jìn)行詳細(xì)的研究，主要包括物料的質(zhì)量控制、除菌過(guò)濾器的選擇及除菌過(guò)濾工藝參數(shù)的研究、除菌過(guò)濾生產(chǎn)過(guò)程的控制等。 

對(duì)于采用過(guò)濾除菌生產(chǎn)工藝的制劑，需注意對(duì)配制藥液使用的原料藥、輔料（包括注射用水）等原材料的微生物種類及數(shù)量進(jìn)行檢查，掌握潛在的污染微生物的總體特性情況，通過(guò)研究確定相應(yīng)的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。采用過(guò)濾除菌生產(chǎn)工藝的制劑所使用的內(nèi)包裝材料，必須采用適當(dāng)?shù)慕?jīng)驗(yàn)證的滅菌工藝處理后方可使用。 

除菌過(guò)濾生產(chǎn)工藝所使用的除菌過(guò)濾器，通常為標(biāo)稱孔徑0.2微米或更小的除菌級(jí)的過(guò)濾器。除菌過(guò)濾器的過(guò)濾效能是評(píng)價(jià)除菌過(guò)濾工藝的重要參數(shù)，需要對(duì)除菌過(guò)濾器的過(guò)濾效能進(jìn)行驗(yàn)證。通常，影響除菌過(guò)濾器的除菌過(guò)濾效能的因素包括：①藥液的性質(zhì)，如藥液的粘度、表面張力、pH值、滲透壓等；② 過(guò)濾步驟的工藝參數(shù)，如過(guò)濾的壓力、流速、時(shí)間、溫度等；③ 除菌過(guò)濾器的相關(guān)參數(shù)，如除菌過(guò)濾器與藥液的相容性、除菌過(guò)濾器的過(guò)濾總量和使用周期等。除菌過(guò)濾器的過(guò)濾效能可因產(chǎn)品和操作條件不同而顯著不同。除菌過(guò)濾器的選擇及工藝參數(shù)的研究可結(jié)合上述影響除菌過(guò)濾器的過(guò)濾效能的因素進(jìn)行。在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中，在過(guò)濾除菌前后均需要進(jìn)行濾器完整性測(cè)試。由于微生物通過(guò)過(guò)濾器的概率隨著待過(guò)濾溶液中微生物數(shù)量的增加而增加，除菌過(guò)濾工藝中需對(duì)待過(guò)濾溶液的微生物負(fù)荷情況進(jìn)行研究和控制，通常情況下，最終除菌過(guò)濾前，料液的微生物負(fù)荷應(yīng)不超過(guò)10cfu/100ml。應(yīng)通過(guò)研究確定無(wú)菌生產(chǎn)各操作環(huán)節(jié)的時(shí)間控制范圍，如料液配制后待過(guò)濾的存放時(shí)間、藥液過(guò)濾操作的時(shí)間、過(guò)濾后至灌裝前放置的時(shí)間、灌封操作的時(shí)間、滅菌后的內(nèi)包裝材料及密封件允許的放置時(shí)間等。各生產(chǎn)環(huán)節(jié)操作時(shí)間的確定需提供相應(yīng)的試驗(yàn)數(shù)據(jù)。 

3.2 無(wú)菌生產(chǎn)工藝的驗(yàn)證 

無(wú)菌生產(chǎn)工藝的驗(yàn)證主要包括培養(yǎng)基模擬灌裝試驗(yàn)，應(yīng)當(dāng)盡可能模擬常規(guī)的無(wú)菌生產(chǎn)工藝，包括所有對(duì)無(wú)菌結(jié)果有影響的關(guān)鍵操作，及生產(chǎn)中可能出現(xiàn)的各種干預(yù)和最差條件。新建的無(wú)菌生產(chǎn)工藝的生產(chǎn)線在正式投產(chǎn)前必須進(jìn)行連續(xù)三批無(wú)菌培養(yǎng)基模擬灌裝試驗(yàn)。在生產(chǎn)用的設(shè)備、設(shè)施、人員結(jié)構(gòu)及工藝方法有重大變更時(shí)都應(yīng)進(jìn)行培養(yǎng)基模擬灌裝試驗(yàn)。實(shí)際生產(chǎn)中每半年應(yīng)至少進(jìn)行一次培養(yǎng)基模擬灌裝試驗(yàn)。 

對(duì)于除菌過(guò)濾無(wú)菌生產(chǎn)工藝的驗(yàn)證，還包括對(duì)除菌過(guò)濾系統(tǒng)的驗(yàn)證，如過(guò)濾器的微生物截留驗(yàn)證、過(guò)濾器與待過(guò)濾藥液的相容性驗(yàn)證、過(guò)濾器的完整性驗(yàn)證等。 

3.2.1培養(yǎng)基模擬灌裝試驗(yàn) 

3.2.1.1培養(yǎng)基 

培養(yǎng)基模擬灌裝試驗(yàn)需要選擇合適的培養(yǎng)基，并對(duì)培養(yǎng)基的質(zhì)量進(jìn)行控制。 

應(yīng)當(dāng)根據(jù)產(chǎn)品的劑型、培養(yǎng)基的選擇性、澄清度、濃度和滅菌的適用性選擇培養(yǎng)基。一般選用胰胨大豆肉湯培養(yǎng)基（TSB），按每30g加1L過(guò)濾純化水的比例，配制足夠量。某些特殊情況下也可以選用厭氧生長(zhǎng)培養(yǎng)基，如硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基（FTM）。 

培養(yǎng)基的質(zhì)量控制主要包括培養(yǎng)基的微生物生長(zhǎng)性能和無(wú)菌性。 

培養(yǎng)基的微生物生長(zhǎng)性能：在按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程制備培養(yǎng)基并滅菌后，可按照中國(guó)藥典附錄進(jìn)行培養(yǎng)基微生物生長(zhǎng)性能試驗(yàn)，確認(rèn)所制備的培養(yǎng)基應(yīng)出現(xiàn)明顯的所接種的微生物的生長(zhǎng)。 

培養(yǎng)基的無(wú)菌性：可按照中國(guó)藥典附錄進(jìn)行培養(yǎng)基無(wú)菌性檢查，結(jié)果應(yīng)符合規(guī)定。 

在培養(yǎng)基模擬灌裝試驗(yàn)中，需進(jìn)行陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)，即取低濃度的菌種接種于進(jìn)行陽(yáng)性試驗(yàn)用的對(duì)照容器中，與培養(yǎng)基模擬灌裝試驗(yàn)在同一條件下進(jìn)行培養(yǎng)。除了中國(guó)藥典附錄中規(guī)定的陽(yáng)性菌，建議使用生產(chǎn)環(huán)境中常見(jiàn)的微生物，如枯草芽孢桿菌、白色念珠球菌，或者在同一生產(chǎn)環(huán)境中曾被檢出過(guò)的菌種。接種量一般每個(gè)容器102以下，每個(gè)菌種接種2瓶，通常需均證實(shí)有菌生長(zhǎng)，該培養(yǎng)基模擬灌裝試驗(yàn)方有效。 

如果試驗(yàn)中需要使用模擬分裝用粉末，同樣需要對(duì)模擬分裝用粉末進(jìn)行選擇和質(zhì)量控制。模擬分裝用粉末的選擇一般遵循以下原則：①可以在干粉狀態(tài)下滅菌，滅菌后的無(wú)菌性達(dá)到藥典規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)；②流動(dòng)性較好，可以用分裝機(jī)分裝；③可溶于液體培養(yǎng)基；④在模擬試驗(yàn)應(yīng)用的濃度下無(wú)抑菌性。常用的模擬分裝材料有乳糖、甘露醇、PEG6000、PEG8000等，也可以采用培養(yǎng)基干粉作為模擬分裝用無(wú)菌粉末。 

3.2.1.2模擬無(wú)菌生產(chǎn)工藝的操作過(guò)程 

培養(yǎng)基模擬灌裝試驗(yàn)中使用的內(nèi)包裝材料的清洗、滅菌，分裝設(shè)備的清洗、消毒及與產(chǎn)品接觸的分裝設(shè)備部件的清洗、滅菌、安裝過(guò)程均應(yīng)遵循與實(shí)際生產(chǎn)操作相同的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程。培養(yǎng)基模擬灌裝試驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)制訂取樣計(jì)劃，對(duì)使用的內(nèi)包裝材料間隔一定數(shù)量后隨機(jī)取樣進(jìn)行無(wú)菌性檢查；同時(shí)，全部與產(chǎn)品接觸的設(shè)備表面應(yīng)無(wú)菌。某些特殊情況下，如膠塞具有抑菌性，則需要考慮更換采用其他相當(dāng)?shù)牡珶o(wú)抑菌性的膠塞。 

應(yīng)當(dāng)注意有足夠數(shù)量的培養(yǎng)基與容器的內(nèi)表面充分接觸，灌裝培養(yǎng)基時(shí)，每個(gè)容器的灌裝體積一般為1/3-1/2之間，最多不能超過(guò)容器的85%。應(yīng)注意，對(duì)于凍干粉針劑的驗(yàn)證試驗(yàn)，在培養(yǎng)基灌裝半壓塞后，只需模擬樣品進(jìn)入和移出凍干機(jī)的過(guò)程即可，而不必模擬凍干過(guò)程，以保證一旦有細(xì)菌，能夠保持較好的生存能力。同時(shí)，還應(yīng)模擬一些可能造成污染的操作步驟，如抽真空，充氮等步驟。 

培養(yǎng)基模擬灌裝試驗(yàn)應(yīng)當(dāng)盡可能模擬常規(guī)的無(wú)菌生產(chǎn)工藝，應(yīng)當(dāng)包括所有對(duì)無(wú)菌結(jié)果有影響的關(guān)鍵操作，包括生產(chǎn)中可能出現(xiàn)的各種干預(yù)和最差條件，各種干預(yù)和最差條件的考慮需要體現(xiàn)風(fēng)險(xiǎn)控制的理念。通?？赡艹霈F(xiàn)的各種干預(yù)和最差條件包括：①人員數(shù)量和他們的活動(dòng)、換班、休息、更衣（需要時(shí)）；②設(shè)備調(diào)試，正常停車、非正常停車、意外事故（如檢修等）；③采用滅菌后所允許放置的最長(zhǎng)時(shí)間的設(shè)備或者車間進(jìn)行生產(chǎn)；④模擬生產(chǎn)時(shí)間最長(zhǎng)的批量所需的時(shí)間；⑤采用最慢的填充速度和最大的包裝容器（即最長(zhǎng)的暴露時(shí)間）；采用最快的填充速度和最小的包裝容器（即容易伴隨更多干預(yù)的生產(chǎn)情況）?？傊谠囼?yàn)計(jì)劃中，總體研究設(shè)計(jì)和運(yùn)行時(shí)間應(yīng)該模擬可能出現(xiàn)的各種干預(yù)和最差操作條件，覆蓋所有實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程涉及的操作。 

培養(yǎng)基模擬灌裝的數(shù)量應(yīng)當(dāng)足以保證評(píng)價(jià)的有效性，批量較小的產(chǎn)品，培養(yǎng)基模擬灌裝的數(shù)量應(yīng)當(dāng)至少等于產(chǎn)品的批量。 

3.2.1.3試驗(yàn)結(jié)果的評(píng)價(jià) 

培養(yǎng)基模擬灌裝試驗(yàn)需要對(duì)所有灌裝樣品進(jìn)行培養(yǎng)和無(wú)菌檢查。培養(yǎng)基模擬灌裝試驗(yàn)的目標(biāo)是零污染，應(yīng)當(dāng)符合以下要求： 

一旦發(fā)現(xiàn)污染，需要進(jìn)行偏差調(diào)查，包括污染菌的鑒別、污染情況的評(píng)估、是否可以重復(fù)進(jìn)行試驗(yàn)等等。 

3.2.2 除菌過(guò)濾系統(tǒng)的驗(yàn)證 

除菌過(guò)濾系統(tǒng)的驗(yàn)證一般包括：微生物截留研究、析出物研究、化學(xué)兼容性研究和藥液吸附研究。 

3.2.2.1微生物截留研究 

過(guò)濾器的微生物截留驗(yàn)證的目的：除菌過(guò)濾器微生物截留試驗(yàn)是通過(guò)模擬實(shí)際過(guò)濾工藝，過(guò)濾含有一定量生物指示菌的溶液，確認(rèn)除菌過(guò)濾器的微生物截留能力。 

過(guò)濾器的微生物截留驗(yàn)證的設(shè)計(jì)： 

（1）挑戰(zhàn)用微生物的選擇 

通常采用缺陷性假單胞菌作為挑戰(zhàn)性試驗(yàn)用菌。在有些情況下，缺陷性假單胞菌可能不能代表最壞條件，則需要考慮采用其他細(xì)菌。如果使用其他細(xì)菌，應(yīng)保證該細(xì)菌足夠細(xì)小至足以挑戰(zhàn)除菌級(jí)別濾器的截留性能，并能模擬產(chǎn)品中發(fā)現(xiàn)的最小微生物。應(yīng)盡可能的進(jìn)行微生物負(fù)荷的鑒別和量化研究，掌握所分離的微生物的形態(tài)學(xué)特征，為挑戰(zhàn)性微生物的選擇提供依據(jù)。 

挑戰(zhàn)性微生物的大小可以通過(guò)其可穿過(guò)0.45微米級(jí)別的濾膜來(lái)確證。通常情況下，標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)的缺陷性假單胞菌，在高挑戰(zhàn)濃度（如≧107）時(shí)，能少量穿過(guò)0.45微米級(jí)別的濾膜。 

（2）微生物截留試驗(yàn)條件 

在試驗(yàn)室模擬生產(chǎn)工藝條件，將定量缺陷性假單胞菌加入到料液中，進(jìn)行過(guò)濾。根據(jù)實(shí)際生產(chǎn)條件，考慮確定微生物截留試驗(yàn)的過(guò)濾時(shí)間及溫度、壓差、流速等。建議對(duì)實(shí)際生產(chǎn)的過(guò)濾工藝進(jìn)行一次徹底評(píng)估，包括溶劑性質(zhì)（例如水性的、酸、堿、有機(jī)的）、過(guò)濾時(shí)間、工藝壓差、工藝流速、工藝溫度和過(guò)濾器設(shè)計(jì)規(guī)范，以便合理設(shè)計(jì)微生物截留試驗(yàn)條件。 

過(guò)濾時(shí)間和壓差會(huì)影響細(xì)菌截留試驗(yàn)的結(jié)果。在完整的生產(chǎn)時(shí)間進(jìn)行微生物截留試驗(yàn)可以對(duì)那些與時(shí)間有關(guān)的因素進(jìn)行評(píng)估，如過(guò)濾器兼容性，完整性的維持，時(shí)間依賴性的穿透等。 

微生物截留試驗(yàn)過(guò)程中的壓差應(yīng)達(dá)到或超過(guò)實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程的最大壓差和/或最大流速（在過(guò)濾器制造商的設(shè)計(jì)規(guī)范內(nèi)）。在驗(yàn)證過(guò)程中同時(shí)模擬壓差和流速可能是不可能的。在設(shè)計(jì)挑戰(zhàn)試驗(yàn)條件時(shí)過(guò)濾器的使用者應(yīng)該確認(rèn)哪個(gè)參數(shù)與特定工藝的相關(guān)性更高，以便為微生物截留試驗(yàn)條件的確定提供依據(jù)。 

微生物截留驗(yàn)證研究應(yīng)包括多個(gè)批次的濾膜（通常三個(gè)批次）。在用于微生物截留驗(yàn)證研究的三個(gè)批次的濾膜中，至少應(yīng)有一個(gè)批次是進(jìn)行預(yù)研究時(shí)或使用前物理完整性測(cè)試時(shí)的數(shù)值通過(guò)但是接近（例如，10％之內(nèi)）過(guò)濾器生產(chǎn)商提供的合格規(guī)范限值的。（3）微生物截留驗(yàn)證研究中使用的過(guò)濾膜的物理完整性檢測(cè)數(shù)值應(yīng)包括在實(shí)驗(yàn)報(bào)告中。物理完整性檢測(cè)應(yīng)使用已有規(guī)范值的水、產(chǎn)品或其它潤(rùn)濕流體來(lái)進(jìn)行測(cè)試，并在進(jìn)行微生物挑戰(zhàn)前完成。 

如果微生物截留驗(yàn)證研究后，測(cè)試用微生物在任何過(guò)濾器的下游被檢測(cè)到，那么就需要對(duì)此進(jìn)行調(diào)查。如果調(diào)查確認(rèn)測(cè)試用微生物能穿透完整性檢測(cè)達(dá)標(biāo)的過(guò)濾器，那么就應(yīng)重新考慮此種過(guò)濾器在這些工作條件下的適用性。 

需要關(guān)注的是，過(guò)濾器的重復(fù)使用通常是不被推薦的。如果需要重復(fù)使用除菌級(jí)過(guò)濾器，需要說(shuō)明理由，重復(fù)使用的相關(guān)參數(shù)（如過(guò)濾量等）也需要經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的驗(yàn)證后確定相應(yīng)的范圍。 

3.2.2.2析出物和釋放物研究 

析出物指在人為或挑戰(zhàn)性條件（如溶劑、溫度或時(shí)間）下，從某一材料中脫離的任何化學(xué)組分。釋放物是指在正常儲(chǔ)存或使用條件下，從接觸面上進(jìn)入產(chǎn)品或工藝流體中的物質(zhì)。潛在的析出物或釋放物的來(lái)源包括但不限于：膜組件（如：成形劑、表面活性劑、抗氧化劑、殘留溶劑、支架層）和塑料組件（如：封蓋、外殼、支架、O型圈）。影響釋放物的因素可能包括過(guò)濾液的化學(xué)性質(zhì)、滅菌方法、接觸時(shí)間、溫度和過(guò)濾量與面積之比。有機(jī)溶液的過(guò)濾產(chǎn)生的釋放物可能比水溶液過(guò)濾要更高。 

析出物數(shù)據(jù)可從過(guò)濾器生產(chǎn)商處獲得，也可以由過(guò)濾器使用者進(jìn)行試驗(yàn)取得。考慮到析出物的來(lái)源不同和影響析出物的因素較多，建議過(guò)濾器使用者在開(kāi)展研究時(shí)盡可能使用實(shí)際產(chǎn)品，并使用與實(shí)際生產(chǎn)相同類型的過(guò)濾器。有些情況下可能需使用替代溶液進(jìn)行試驗(yàn)，例如，產(chǎn)品會(huì)干擾分析方法或產(chǎn)品有抑菌性等。這時(shí)，替代溶液必須與待過(guò)濾產(chǎn)品性質(zhì)盡可能一致。另外，也可以選擇使用幾種溶液來(lái)涵蓋實(shí)際過(guò)濾溶液的pH、離子強(qiáng)度或有機(jī)成分的含量等特性。如果使用了替代溶液或幾種溶液合并的方式，則必須提供溶液選擇的合理依據(jù)。 

一旦確定好用于析出試驗(yàn)的萃取溶液（產(chǎn)品、替代液或幾類溶液合并使用），則應(yīng)在設(shè)計(jì)試驗(yàn)時(shí)模擬實(shí)際生產(chǎn)條件下最劣工況，具體應(yīng)考慮諸如溫度、時(shí)間、pH和預(yù)處理（如：沖洗、滅菌）工序等關(guān)鍵變量。析出試驗(yàn)應(yīng)采用過(guò)濾裝置處于最劣生產(chǎn)條件時(shí)的接觸時(shí)間和溫度，使用經(jīng)過(guò)高壓滅菌或消毒過(guò)的過(guò)濾器來(lái)完成?？梢杂渺o態(tài)浸泡或循環(huán)流動(dòng)的方法。采用靜態(tài)浸泡法時(shí)，過(guò)濾器在給定溫度的析出溶液中浸泡一段既定的時(shí)間。而采用循環(huán)流動(dòng)法時(shí)，萃取液在既定的時(shí)間內(nèi)循環(huán)反復(fù)穿越過(guò)濾器。將萃取液收集并檢測(cè)，從而確定其中的過(guò)濾器析出物。 

在取得過(guò)濾器萃取液后，通過(guò)分析可以確定來(lái)自過(guò)濾器的物質(zhì)種類和含量。除了對(duì)過(guò)濾器析出物的種類和含量進(jìn)行確定外，必要時(shí)還可以采用已被認(rèn)可的生物反應(yīng)性試驗(yàn)對(duì)其安全性進(jìn)行評(píng)估。 

 3.2.2.3 相容性研究 

過(guò)濾器的相容性研究用來(lái)評(píng)估過(guò)濾裝置與料液的化學(xué)相容性，以避免可能的過(guò)濾器受損或變形，并能防止料液受到釋放物或微粒物質(zhì)的污染?；瘜W(xué)相容性試驗(yàn)應(yīng)涵蓋整個(gè)裝置，試驗(yàn)的設(shè)計(jì)應(yīng)考慮料液性質(zhì)、過(guò)濾溫度和接觸時(shí)間等。由于過(guò)濾裝置與過(guò)濾料液或溶劑之間可能存在諸多化學(xué)相互作用，過(guò)濾器生產(chǎn)商所提供的代表性的化學(xué)相容性表通常只作為過(guò)濾器使用者的參考，過(guò)濾器使用者需要進(jìn)行更全面的測(cè)試。通常的化學(xué)相容性試驗(yàn)包括：接觸料液前后的目視檢查、過(guò)濾過(guò)程中流速變化、濾膜重量變化、過(guò)濾前后起泡點(diǎn)變化等。 

3.2.2.4 吸附性研究 

吸附是所過(guò)濾的料液中的某些成分粘附在濾膜上的過(guò)程，可能影響料液的構(gòu)成和濃度。過(guò)濾器中吸附性的材料包括濾膜、硬件和支撐性材料。吸附試驗(yàn)條件可以根據(jù)實(shí)際生產(chǎn)條件確定，流速、過(guò)濾時(shí)間、料液濃度、防腐劑濃度、溫度和pH值等因素都可能影響吸附效果。吸附試驗(yàn)中采用的檢測(cè)方法可以采用產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中所確定的相關(guān)檢測(cè)方法。 

4原料藥無(wú)菌生產(chǎn)工藝 

無(wú)菌原料藥是指在法定的藥品標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定無(wú)菌檢查項(xiàng)目的原料藥?；瘜W(xué)原料藥的常用生產(chǎn)工藝包括化學(xué)合成工藝、微生物發(fā)酵工藝，以及采用微生物發(fā)酵產(chǎn)品作為起始原料的半合成工藝；而原料藥的無(wú)菌工藝特指對(duì)制成的原料藥進(jìn)行無(wú)菌化處理的相關(guān)工藝，無(wú)菌工藝之前的生產(chǎn)過(guò)程不屬本章節(jié)的討論范疇。但對(duì)于用于無(wú)菌制劑生產(chǎn)的無(wú)菌輔料（如鹽酸精氨酸、碳酸氫鈉等）的無(wú)菌工藝驗(yàn)證也可以參考本指導(dǎo)原則的相關(guān)要求。 

與無(wú)菌制劑工藝相比，無(wú)菌原料藥的生產(chǎn)工藝一般要更復(fù)雜，設(shè)備類型多種多樣，且不同的工藝有不同的特點(diǎn)。工藝過(guò)程中的物料、內(nèi)包裝材料、設(shè)備（包括閥門、管道等相關(guān)部件）的滅菌和無(wú)菌傳遞、對(duì)接、組裝等操作相比無(wú)菌制劑要復(fù)雜的多。原料藥從非無(wú)菌轉(zhuǎn)化成無(wú)菌狀態(tài)的常用方法是通過(guò)除菌過(guò)濾來(lái)實(shí)現(xiàn)。該過(guò)程受料液性質(zhì)影響很大，需要根據(jù)料液的性質(zhì)選擇適當(dāng)?shù)倪^(guò)濾器及濾芯的材質(zhì)。另外，原料藥的生產(chǎn)設(shè)備通常體積較大且內(nèi)部結(jié)構(gòu)復(fù)雜，在選擇放置位置或進(jìn)行投料、取樣、回收操作時(shí)應(yīng)考慮如何保證潔凈區(qū)內(nèi)的氣流流向符合要求，以及如何匹配好高效過(guò)濾器的位置與設(shè)備本體之間的位置分布等。 

盡管無(wú)菌制劑和無(wú)菌原料藥在生產(chǎn)過(guò)程和質(zhì)量控制特點(diǎn)上存在諸多不同，但就無(wú)菌保證的基本原則，以及生產(chǎn)管理和驗(yàn)證的基本原則而言，兩者的要求又是相通的。因此在生產(chǎn)設(shè)備、廠房設(shè)施、潔凈級(jí)別及監(jiān)測(cè)、滅菌工藝與方法及質(zhì)量控制要求等方面，無(wú)菌原料藥和無(wú)菌制劑的要求可以相互參考。 

4.1 無(wú)菌原料藥生產(chǎn)工藝特點(diǎn) 

無(wú)菌原料藥可以通過(guò)最終滅菌或非最終滅菌的方式獲得。對(duì)于采用最終滅菌的無(wú)菌原料藥，必須嚴(yán)格控制微生物污染、細(xì)菌內(nèi)毒素和不溶性微粒的水平。由于多數(shù)原料藥的耐熱性較差，所以通常無(wú)菌原料藥采用非終端滅菌的方式生產(chǎn)。 

無(wú)菌原料的精制過(guò)程和除菌過(guò)程經(jīng)常結(jié)合在一起，作為生產(chǎn)工藝的一個(gè)單元操作來(lái)完成。目前生產(chǎn)上最常用的方法是無(wú)菌過(guò)濾法；即將非無(wú)菌的中間體或原材料配制成溶液，再通過(guò)0.22μm孔徑的過(guò)濾器以達(dá)到除去細(xì)菌的目的。無(wú)菌原料藥常用工藝包括溶媒結(jié)晶和冷凍干燥兩種，前期國(guó)內(nèi)也有采用噴霧干燥工藝的無(wú)菌原料藥，但是多因?yàn)槠渖a(chǎn)工藝不能滿足無(wú)菌工藝的驗(yàn)證要求而逐漸被放棄或進(jìn)行了工藝變更。無(wú)菌過(guò)濾溶媒結(jié)晶工藝和冷凍干燥工藝涉及的具體設(shè)備和操作各不相同，但都采用除菌過(guò)濾的方式使料液從非無(wú)菌狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)菌狀態(tài)，并且要在此后的干燥、粉碎、混合以及分裝過(guò)程中始終保持無(wú)菌狀態(tài)。 

4.1.1 溶媒結(jié)晶工藝 

典型的溶媒結(jié)晶工藝流程包括非無(wú)菌原料藥的溶解、除菌過(guò)濾、結(jié)晶、固液分離（如常用過(guò)濾、離心等方法）、洗滌、干燥、粉碎、混合、分裝等過(guò)程。溶解環(huán)節(jié)應(yīng)關(guān)注物料的微生物負(fù)荷、溶劑的質(zhì)量、設(shè)備的微生物污染水平以及使用的料液輸送動(dòng)力源（如空氣或氮?dú)猓┑奈⑸镂廴舅?。除菌過(guò)濾環(huán)節(jié)應(yīng)關(guān)注濾器本身的無(wú)菌性、過(guò)濾器與料液的相容性、濾芯本身及裝配后的完整性、過(guò)濾器的清洗及滅菌周期、過(guò)濾器的除菌效率、除菌濾器前料液的微生物污染水平等。結(jié)晶環(huán)節(jié)應(yīng)關(guān)注設(shè)備無(wú)菌性、密封性及密封裝置的可靠性、設(shè)備的清洗及滅菌周期、呼吸器的完整性及無(wú)菌性；如需加入晶種，晶種本身應(yīng)符合無(wú)菌藥品的要求，并且應(yīng)驗(yàn)證晶種加入過(guò)程的無(wú)菌保證。過(guò)濾或離心環(huán)節(jié)應(yīng)關(guān)注設(shè)備無(wú)菌性、密封性能及密封裝置的可靠性、清洗及滅菌周期、呼吸器的完整性及無(wú)菌性等。洗滌環(huán)節(jié)應(yīng)關(guān)注洗滌溶劑的無(wú)菌性。干燥環(huán)節(jié)應(yīng)關(guān)注干燥設(shè)備無(wú)菌性、密封性能及密封裝置的可靠性、清洗及滅菌周期、呼吸器的完整性及無(wú)菌性，以及真空系統(tǒng)的防倒吸設(shè)置（如使用真空，應(yīng)在管路上安裝除菌級(jí)別的過(guò)濾器）。粉碎環(huán)節(jié)應(yīng)關(guān)注設(shè)備無(wú)菌性、密封性能及密封裝置的可靠性；粉碎用氣體（如使用氣流粉碎機(jī)）的無(wú)菌保證、給料方式的無(wú)菌保證水平等。混合環(huán)節(jié)應(yīng)關(guān)注設(shè)備無(wú)菌性、密封性能及密封裝置的可靠性、清洗及滅菌周期等。分裝環(huán)節(jié)應(yīng)關(guān)注分裝設(shè)備本身的無(wú)菌性或者其產(chǎn)品暴露潔凈級(jí)別是否達(dá)到A級(jí)區(qū)標(biāo)準(zhǔn)，關(guān)注內(nèi)包裝材料的無(wú)菌性、內(nèi)包裝材料的遞入方式、內(nèi)包裝容器的密封性以及取樣環(huán)節(jié)的無(wú)菌保證。 

4.1.2 冷凍干燥工藝 

凍干無(wú)菌原料藥的典型流程包括原料藥的溶解、除菌過(guò)濾、冷凍干燥、粉碎、混合和分裝。其中除冷凍干燥環(huán)節(jié)外，其它工藝步驟的關(guān)注重點(diǎn)可參考溶媒結(jié)晶工藝的相關(guān)要求。凍干工藝環(huán)節(jié)中應(yīng)關(guān)注的主要問(wèn)題包括凍干機(jī)本身及附屬裝置的無(wú)菌性、密封性能及密封裝置的可靠性、清洗及滅菌周期、設(shè)備的可清洗及可滅菌性；真空系統(tǒng)的保證及干燥后的壓力平衡，補(bǔ)氣過(guò)程的無(wú)菌保證（宜補(bǔ)充無(wú)菌氣體或者在凍干機(jī)上安裝除菌呼吸過(guò)濾器），以及物料進(jìn)出設(shè)備時(shí)的無(wú)菌保證。 

4.2 無(wú)菌原料藥工藝驗(yàn)證 

采用終端滅菌工藝的無(wú)菌原料藥工藝驗(yàn)證可參考制劑終端滅菌工藝驗(yàn)證的相關(guān)要求。非終端滅菌的無(wú)菌原料藥工藝驗(yàn)證主要包括培養(yǎng)基模擬灌裝驗(yàn)證和過(guò)濾除菌系統(tǒng)驗(yàn)證。其中的過(guò)濾除菌系統(tǒng)驗(yàn)證可參考無(wú)菌制劑的相關(guān)要求，并重點(diǎn)關(guān)注進(jìn)入結(jié)晶罐的所有物料（如原料藥、溶媒、酸堿、氣體等）均應(yīng)除菌過(guò)濾，并進(jìn)行相關(guān)驗(yàn)證。 

4.2.1 驗(yàn)證批量 

常規(guī)生產(chǎn)批量較小的無(wú)菌原料藥，應(yīng)最大限度模擬大生產(chǎn)的批量。對(duì)于常規(guī)生產(chǎn)批量較大的無(wú)菌原料藥，考慮到模擬大生產(chǎn)批量的可行性和實(shí)際介質(zhì)培養(yǎng)的可行性，模擬灌裝批量可以比大生產(chǎn)批量小，但模擬介質(zhì)應(yīng)能夠接觸到所有產(chǎn)品可能接觸的設(shè)備內(nèi)表面。并能夠充分模擬實(shí)際生產(chǎn)可能遇到的其它各種最差條件。 

4.2.2 最差條件 

選擇最差條件時(shí)，應(yīng)考慮進(jìn)出人數(shù)（包括維修人員）、生產(chǎn)材料、設(shè)備設(shè)施在無(wú)菌區(qū)的暴露時(shí)間、設(shè)備滅菌后至開(kāi)始灌裝前的間隔時(shí)間，以及微生物抑制因素（如溫度、氮保護(hù)、抗生素）的調(diào)整和消除等。應(yīng)確認(rèn)模擬介質(zhì)是否能接觸到實(shí)際生產(chǎn)工藝過(guò)程中所有無(wú)菌產(chǎn)品可能接觸到的表面，時(shí)間間隔是否具有可比性（比如溶解過(guò)濾時(shí)間應(yīng)不短于實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中使用的時(shí)間），可將時(shí)間延長(zhǎng)來(lái)模擬最差條件，如果縮短時(shí)間來(lái)模擬，需要說(shuō)明/論證是否縮短時(shí)間后的條件可等同于生產(chǎn)工藝的最差條件。 

其它要求可參考無(wú)菌制劑的驗(yàn)證相關(guān)內(nèi)容。 

附件1：滅菌工藝選擇的決策樹(shù)

溶液劑型產(chǎn)品滅菌方法選擇的決策樹(shù)

附件2：D值的測(cè)定方法 

一般可以采用毛細(xì)管暴熱計(jì)時(shí)法測(cè)定污染微生物的耐熱參數(shù)D值，測(cè)定主要包括以下幾個(gè)步驟： 

①制樣：將產(chǎn)品中的微生物分離，將菌膜或者孢子懸浮液分別放入注射用水或者磷酸鹽緩沖液中，采用適宜的設(shè)備振動(dòng)使其分散均勻，制備成濃度約為108個(gè)/ml的懸浮液，然后在沸水中加熱約10分鐘以殺滅可能存在的芽孢繁殖體。 

②測(cè)定：將上述懸浮液注入適宜長(zhǎng)度的毛細(xì)管中，使每管的菌量為106個(gè)孢子，封口，置于校正過(guò)的121℃的油浴中曝?zé)?。每?-3分鐘取出兩支毛細(xì)管并迅速冷卻，制備孢子溶液，培養(yǎng)后計(jì)數(shù)。 

③計(jì)算：根據(jù)公式lgNt=lgN0-t/D ，其中，N0和Nt分別為零時(shí)和曝?zé)醫(yī) 時(shí)間的孢子的濃度。 

由以上的D值的測(cè)定方法可知，測(cè)定所需的儀器并不非常復(fù)雜，但需要專業(yè)技術(shù)人員和經(jīng)驗(yàn)的積累。在不具備D值測(cè)定條件時(shí)，可以采用測(cè)定污染菌的耐熱性來(lái)代替。 

附件3：生物指示劑用量的確定方法。 

① 陰性分?jǐn)?shù)法 

根據(jù)公式： 
F0=L×t，其中L為滅菌溫度的滅菌率（Z=10），t為滅菌時(shí)間。 

SLR=FO/Dbi  ，其中SLR為spore log reduction，即孢子對(duì)數(shù)下降值，Dbi為所選用的生物指示劑的D值。 

SLR=lgNO- lgNt  ，其中NO為滅菌前容器內(nèi)初始孢子數(shù)，Nt為滅菌后容器內(nèi)殘存孢子數(shù)。 

lgNt=2.303×lg(n/q) ，其中n為挑戰(zhàn)性試驗(yàn)瓶樣品總數(shù)，q為挑戰(zhàn)性試驗(yàn)結(jié)果為陰性的瓶數(shù)) 

可以得到： 

lgNO  =lgNt +SLR= 2.303×lg(n/q) + FO/Dbi  =2.303×lg(n/q) + L×t /Dbi 

當(dāng)濕熱滅菌工藝的滅菌溫度和滅菌時(shí)間確定后，L、t可以確定；生物指示劑確定后，Dbi可以確定；微生物挑戰(zhàn)試驗(yàn)方案確定后，n、q可以確定。所以，通過(guò)以上的幾個(gè)公式，可以計(jì)算出生物指示劑的用量，即NO。 

需要說(shuō)明的是，在常規(guī)的生產(chǎn)條件下，如采用115℃滅菌30分鐘，假定采用的生物指示劑的D值為1，那么，計(jì)算得到的生物指示劑的用量為106，這也是微生物挑戰(zhàn)試驗(yàn)時(shí)常規(guī)采用的用量。 

② 殘存曲線法 

根據(jù)公式： 
FT/Dbi = lgNO  +1，其中FT 為T滅菌值，即給定Z（Z=10）值下，滅菌程序在溫度T下的等效滅菌時(shí)間，F(xiàn)T= F0/L；Dbi為所選用的生物指示劑的D值；NO為滅菌前容器內(nèi)初始孢子數(shù)。 

當(dāng)濕熱滅菌工藝的滅菌溫度確定后，L可以確定；生物指示劑確定后，Dbi可以確定；當(dāng)F0設(shè)定后，即可計(jì)算出生物指示劑的用量，即NO。

轉(zhuǎn)自：制藥質(zhì)量、研發(fā)、注冊(cè)交流